ELISA測定現通常為采用手工操作的以微孔板條為固相的測定模式，測定操作非常簡單，一般涉及到標本的收集保存、試劑準備、加樣、溫育、洗板、顯色、比色、結果判斷和結果報告及解釋等方面，其中任一步驟的不當都會影響測定結果，且尤以加樣、溫育和洗板等步驟為甚。現分述ELISA常見問題與解決方法：

1. 陰性對照出現陽性結果

①  樣品、試劑被污染，或加樣時操作不當導致相鄰孔之間溶液濺灑出現交叉污染——更換試劑，小心操作。

② 酶標板洗滌不*——洗板前先將抗體溶液倒干凈，然后清洗液倒滿板孔，確保能充分洗滌。

③ 抗體量過多導致非特異性結合——根據說明書的推薦量使用抗體，稀釋抗體到適當濃度。

2．酶標板整體背景高

① 抗體非特異性結合——應確保板孔進行了封閉并且使用的是恰當的封閉液以防止非特異性結合。

② 底物結合濃度過高——對底物進行適當稀釋。

③ 反應時間過長——當酶標板顯色足夠進行吸光度讀數時立即使用終止液終止反應，適當縮短顯色時間。

④ 底物溶液污染——正常底物溶液應是澄清透明的，若出現黃色或其他顏色表明受到污染，應更換新的底物溶液。

⑤ 底物孵育過程沒有避光——底物孵育應在避光條件下進行。

3. 復孔之間重復性差

① 樣品數量不整齊，加樣時間有長有短——加重復孔時盡量保持加樣時間與第一次接近。

② 加樣量不一致——樣品稀釋前應充分混勻，并且使用同一移液槍。

③ 洗滌條件、操作人員不一致——重復測定樣品時，操作條件、人員應盡可能與上次保持一致。

4. 吸光值偏高或偏低

① 樣品中待測抗原含量太低會導致測定結果偏低——可嘗試增加樣品使用量。

② 加入抗體量不合適會造成結果偏低或偏高——使用建議抗體量或為了使結果更好盡可能調整抗體的適用量。

③ 孵育時間太短導致檢測結果偏低——適當延長抗體或抗原的孵育時間，確保待測樣品與檢測抗體能充分結合。

④ 孵育溫度不適合——應保證抗體在最適宜條件下進行孵育（一般37℃孵育1h）。