基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三個(gè)溫度點(diǎn)。在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點(diǎn)法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40 ～60℃，引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對于較短靶基因（長度為100～300bp時(shí)）可采用二溫度點(diǎn)法， 除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸（此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性）。

1、變性溫度與時(shí)間：

變性溫度低，解鏈不*是導(dǎo)致PCR失敗的最主要原因。一般情況下，93℃～94℃min足以使模板DNA變性，若低于93℃則需延長時(shí)間，但溫度不能過高，因?yàn)楦邷丨h(huán)境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物*變性，就會導(dǎo)致PCR失敗。

2、退火（復(fù)性）溫度與時(shí)間：

退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板DNA 比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機(jī)會遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞。退火溫度與時(shí)間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。對于20個(gè)核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇最適退火溫度的起點(diǎn)較為理想。引物的復(fù)性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：

Tm值（解鏈溫度）=4(G+C)+2(A+T)

復(fù)性溫度=Tm值-(5～10℃）

在Tm值允許范圍內(nèi)， 選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合， 提高PCR反應(yīng)的特異性。復(fù)性時(shí)間一般為30～60sec，足以使引物與模板之間*結(jié)合。

3、延伸溫度與時(shí)間：Taq DNA聚合酶的生物學(xué)活性：

70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子

70℃ 60核苷酸/S/酶分子

55℃ 24核苷酸/S/酶分子

高于90℃時(shí)， DNA合成幾乎不能進(jìn)行。

PCR反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在70～75℃之間，常用溫度為72℃，過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。PCR延伸反應(yīng)的時(shí)間，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長度而定，一般1Kb以內(nèi)的DNA片段，延伸時(shí)間1min是足夠 的。3～4kb的靶序列需3～4min；擴(kuò)增10Kb需延伸至15min。延伸時(shí)間過長會導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)。對低濃度模板的擴(kuò)增，延伸時(shí)間要稍長些。