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      PCR實驗預準備事項
    1. 發布日期:2023-12-11      瀏覽次數:408
      •     實時熒光定量PCR技術,是指在PCR反應體系中加入熒光基團,利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程,最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。PCR實驗是分子生物學中常見用的實驗之一,在基因擴增、核酸檢測、基因檢測等方面廣泛應用。PCR實驗前的準備:
        在開始PCR實驗之前,必須準備好DNA模板(基因組DNA或逆轉錄制備的cDNA)、特異性引物(自己設計或用軟件設計),并選擇合適的商業酶(選擇符合您實驗目的的酶)

        1、DNA聚合酶。有許多商業 DNA 聚合酶,它們具有不同的特性。一般分為兩類:高保真聚合酶和普通Taq聚合酶。如果您想對沒有任何突變的特定 DNA 片段進行 PCR,請選擇高保真聚合酶。如果只是想檢測特定序列的存在,就選擇普通的Taq聚合酶。如果要對T-vector連接的片段進行PCR,要注意,因為大多數高保真聚合酶的產物都沒有A-tailing,所以應該選擇普通的Taq聚合酶或在PCR實驗后添加A-tailing


        2、引物的特異性影響 PCR 成功的概率,良好的引物設計對 PCR 擴增的成功至關重要。當您開始設計引物時,應仔細考慮以下幾個原則:
        ①引物的長度。PCR引物一般在18-22bp左右。這對于引物特異性和在退火溫度下的結合來說是足夠長的。
        ②熔化溫度(Tm)Tm 定義為在此溫度下,DNA 雙鏈體的一半將解離成單鏈 DNA52-58C 范圍內的引物 Tm 是最佳的。
        GC 含量。最佳 GC 含量應為 40-60%
        ④許多軟件可用于引物設計,例如primer5Oligo。這些軟件推薦的引物通常可以滿足我們的需求。


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