細(xì)胞凍存是細(xì)胞保存的主要方法之一。利用凍存技術(shù)將細(xì)胞置于-196℃液氮低溫保存，可以使細(xì)胞暫時(shí)脫離生長(zhǎng)狀態(tài)而將細(xì)胞特性保存起來，這樣在需要的時(shí)候再復(fù)蘇細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。適度的保存一定量的細(xì)胞，可以防止因正在培養(yǎng)的細(xì)胞被污染或其他意外事件而使細(xì)胞丟種，起到細(xì)胞保種的作用。

貼壁細(xì)胞凍存操作步驟：

1. 制備凍存液，凍存液比例：實(shí)驗(yàn)室采用90% FBS+10% DMSO；

2. 取形態(tài)良好，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，吸出舊培養(yǎng)基，加PBS沖洗一次；

3. yi酶消化細(xì)胞，鏡下觀察細(xì)胞，待細(xì)胞全變圓后，加全培養(yǎng)基終止消化，800g離心5min收集細(xì)胞；

4. 棄去離心管上清液，加入凍存液重懸細(xì)胞，小心打開凍存管管蓋，每管分裝1-1.5mL含細(xì)胞的凍存液，擰緊蓋管，做好標(biāo)記；

5. 分裝好的凍存管轉(zhuǎn)入程序降溫盒后直接放-80℃過夜；

6. 若沒有程序降溫盒，則按下列順序依次降溫：

室溫→4℃20min→-20℃30min→-80℃過夜，注意轉(zhuǎn)移過程中要保冷，避免產(chǎn)生溫差或凍存管融化；

7. 從-80℃冰箱取出凍存管迅速轉(zhuǎn)移到液氮長(zhǎng)期保存。

注意事項(xiàng)：

1. 必須始終穿戴適當(dāng)?shù)膫€(gè)人防護(hù)設(shè)備，手套污染時(shí)應(yīng)當(dāng)更換，將用過的手套與其他污染的實(shí)驗(yàn)室廢物一起處置。

2. 實(shí)驗(yàn)前和實(shí)驗(yàn)后需要滅菌處理，實(shí)驗(yàn)前，實(shí)驗(yàn)臺(tái)打開紫外燈照射20-30分鐘，實(shí)驗(yàn)后需要用75%酒精擦拭超凈臺(tái)、邊臺(tái)、倒置鏡的載物臺(tái)。

3. 凡是帶入超凈工作臺(tái)內(nèi)的酒精、PBS、培養(yǎng)基、 yi蛋白酶的瓶子均要75％酒精擦拭瓶子的外表面，靠近酒精燈火焰操作。

4. 凍存時(shí)細(xì)胞濃度低于1-5×106個(gè)/ml。

5. 凍存前注意切勿消化時(shí)間過長(zhǎng)、吹打力度過重、離心轉(zhuǎn)速過大或離心時(shí)間過長(zhǎng)，以免造成細(xì)胞損傷。

6. 凍存細(xì)胞長(zhǎng)期保存應(yīng)放置于液氮，不建議在-80℃長(zhǎng)期保存。

7. 細(xì)胞離心后盡量吸干凈上清液，減少培養(yǎng)基殘留，避免稀釋凍存液。

8. DMSO溶于培養(yǎng)基時(shí)，將釋放大量熱量，所以細(xì)胞凍存液需提前配制，冷卻后再使用，不能直接將DMSO加入含有細(xì)胞的培養(yǎng)基中，避免燙傷細(xì)胞。