ELISA實驗中應該注意的問題，包括樣品稀釋、試劑盒平衡、樣品和試劑的混勻、加樣、溫育等問題。ELISA試劑盒有著準確性高、靈敏度高、特異性強的諸多優點。然而,在實驗過程中,也需要注意很多問題。對此， 需要遵守一些規則,才能更好地進行實驗,取得較好的實驗成果。

          ELISA方法被廣泛應用于各種抗原和抗體測定。在ELISA測定中影響因素較多,在檢測過程中除正常反應外,有時常見到一些錯誤的結果。引起ELISA測定錯誤結果的原因主要有：標本因素；試劑因素；操作因素。ELISA實驗過程需注意事項匯總如下：

1．樣品稀釋

一般產品的樣品稀釋倍數均通過大量試驗確定,以保證試驗的靈敏度和特異性.酶聯免疫反應是一種敏感性很高的反應,如果血清不稀釋,不可避免會產生很強的非特異性反應,出現假陽性。

2．試劑盒平衡

Elisa中所有試劑和板條均應在試驗前平衡至室溫(約25℃),一般需在室溫放置20～30分鐘以上.平衡時間太短會造成試劑混勻不夠,樣品孵育時間相對縮短,ELISA反應不夠充分.冬季室溫低,可將試劑盒置37℃溫箱20分鐘。

3．樣品和試劑的混勻

在稀釋前、后的樣品必須充分混勻,所有試劑在加樣前也須搖勻,以保證試驗的均一性。

4．加樣

加樣是一項很重要的步驟.加樣不可太快,要避免加在孔壁上部,不可濺出和產生氣泡.加樣太快,無法保證微量加樣的準確性和均一性.加在孔壁上部的非包被區,易導致非特異吸附。

5．溫育

溫育是ELISA測定中影響測定成敗最為關鍵的一個因素.ELISA作為一種固相免疫測定,抗原抗體的結合反應在固相上進行,要使液相中的抗原或抗體與固相上的特異抗體或抗原全結合,必須在一定的溫度條件下反應一定的時間。

6．洗板

固相免疫測定技術是一種非均相免疫測定技術,需以洗滌操作將特異結合于固相的抗原或抗體與反應溫育過程中吸附的非特異成份分離開來,以保證ELISA測定的特異性.洗液盡量不要溢出孔外；加洗液后要靜置1分鐘,甩去板孔中洗液后,一定要大力拍干；及時更換吸水紙,尤其是拍過酶標記物的吸水紙一定要棄去,否則可能影響試驗結果。

7．顯色

顯色一定要控制時間,根據試劑盒說明操作即可.一般來說,顯色時間過短,結果偏低；顯色時間過長,空白增高或者非特異性顯色增加。

8．比色

比色要注意波長的選擇.以TMB為底物和以OPD為底物的試劑盒均有使用,而前者比色波長為450nm,后者為492nm,濾光片需根據要求隨時更換.因此,容易出現濾光片錯用的問題。