BCA(Bicinchoninic Acid)法是一種常用的蛋白定量檢測(cè)方法，其原理是利用蛋白質(zhì)與銅離子在堿性溶液中發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，生成穩(wěn)定的紫紅色復(fù)合物，再與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)比較，即可求出待測(cè)蛋白的濃度。該方法具有靈敏度高、準(zhǔn)確度高、操作簡(jiǎn)便、抗干擾能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)等領(lǐng)域。
二、實(shí)驗(yàn)步驟
1.試劑準(zhǔn)備
(1)BCA工作液：將BCA試劑A和B按50:1的比例混合，充分搖勻，備用。
(2)標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液：取適量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白，用PBS或去離子水溶解，配制成濃度為1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液。
2.蛋白樣品制備
(1)細(xì)胞裂解：將細(xì)胞樣品離心，去除上清液，加入適量的細(xì)胞裂解液，在冰上裂解30min，使細(xì)胞充分裂解。
(2)去除雜質(zhì)：將裂解后的樣品離心，去除沉淀，保留上清液。在上清液中加入適量的SDS，使終濃度為0.1%，充分混勻。
(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制備：取適量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，加入適量的SDS，使終濃度為0.1%，然后分別稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液。取96孔板，分別加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。在每個(gè)孔中加入BCA工作液，充分混勻。然后按照說(shuō)明書(shū)要求，在特定波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
3.蛋白定量檢測(cè)
(1)取適量的待測(cè)蛋白樣品，加入適量的SDS，使終濃度為0.1%，充分混勻。然后按照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備方法，加入BCA工作液，測(cè)量吸光度值。
(2)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，查找出待測(cè)蛋白樣品的濃度。如果待測(cè)蛋白樣品濃度較高，可以進(jìn)行適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行測(cè)定。
三、注意事項(xiàng)
1.BCA工作液應(yīng)儲(chǔ)存于4℃避光保存，避免反復(fù)凍融。
2.實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)保持樣品和標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液的pH值一致，以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。
3.在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)避免交叉污染，以免影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
4.對(duì)于一些特殊的蛋白質(zhì)樣品，可能需要采用其他方法進(jìn)行定量檢測(cè)。
