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      細胞冷凍步驟及注意事項
    1. 發布日期:2025-04-27      瀏覽次數:138
      • 步驟:

        (1)冷凍前24-48小時更換半量或全量培養基,使細胞處于指數生長期。

        (2)配制冷凍保存溶液(使用前配制):另取一離心管,加入培養基、血清,逐滴加入二甲基亞砜(DMSO)至20%濃度,即制成雙倍的凍存液,置于室溫下待用。

        (3)離心收集培養之細胞,用加血清的培養基重懸起細胞,取少量細胞懸浮液(約0.1ml)計數細胞濃度及凍前存活率。

        (4)取與細胞懸液等量的凍存液,緩慢逐滴加入細胞懸液,并晃動試管,制成細胞凍存懸液(DMSO最后濃度為5~10%),使細胞濃度為1~5×106cells/ml,混合均勻,分裝于已標示全之冷凍保存管中,1~2ml/vial,并取少量細胞懸浮液作污染檢測。嚴密封口后,注明細胞名稱、代數、日期。然后進行凍存。

        注意事項:

        (1)欲冷凍保存之細胞應在生長良好(logphase)且存活率高之狀態,約為80~90%致密度。冷凍前檢測細胞是否仍保有其te有性質,例如hybridoma應在冷凍保存前一至二日測試是否有抗體之產生。

        (2)細胞在液氮中可長期凍存無限shi間,而不會影響細胞活力;在-70度可保存數月。

        (3)注意冷凍保護劑之品質。DMSO應為試劑級等級,無菌且無色(以0.22micron FGLP Telflon過濾或是直接購買無菌產品,如Sigma D-2650),以5~10ml小體積分裝,4℃避光保存,勿作多次解凍。Glycerol亦應為試劑級等級,以高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開啟后一年內使用,因長期儲存后對細胞會有毒性。本方法中先制備雙倍凍存液,可避免DMSO直接加入時釋放的熱量對細胞的損傷。緩慢逐滴加入細胞懸液是使細胞逐步適應高滲,可降低細胞受損。DMSO可能引起部分白血病細胞株的分化,可換用10%甘油凍存。


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