夾心 ELISA 測定兩層抗體（捕獲抗體和檢測抗體）之間的抗原。目標(biāo)抗原必須包含至少兩個(gè)能夠結(jié)合到抗體的抗原表位。單克隆或多克隆抗體均可在夾心 ELISA 系統(tǒng)中用作捕獲抗體和檢測抗體。單克隆抗體識(shí)別單一表位，可對(duì)抗原中微小差別進(jìn)行定量檢測。多克隆抗體通常用作捕獲抗體以沉降盡可能多的抗原。

夾心 ELISA 省去了分析之前的樣品純化步驟，而且提高了分析靈敏度（靈敏度比直接或間接 ELISA 高 2-5 倍）。

夾心 ELISA 程序可能難以優(yōu)化，應(yīng)使用已測試的匹配抗體對(duì)。這樣可確保抗體檢測靶蛋白上的不同表位，而不會(huì)干擾其它抗體結(jié)合。我們不能保證我們的抗體可用于夾心 ELISA，除非它們已經(jīng)過專門的測試。

雙抗體夾心法是檢測抗原zui常用的方法，操作步驟如下：

1、將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體：洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。

2、加受檢標(biāo)本：使之與固相抗體接觸反應(yīng)一段時(shí)間，讓標(biāo)本中的抗原與固相載體上的抗體結(jié)合，形成固相抗原復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)。

3、加酶標(biāo)抗體：使固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。徹di洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。此時(shí)固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量正相關(guān)。

4、加底物：夾心式復(fù)合物中的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量。

根據(jù)同樣原理，將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標(biāo)抗原結(jié)合物，即可用雙抗原夾心法測定標(biāo)本中的抗體。