川牛膝探針法PCR鑒定試劑盒說明書

儲(chǔ)存條件：
14℃或－20℃樣品收集、處理及保存方法
1. 血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細(xì)胞刺激，收集血液后，3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。
2. 血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000 轉(zhuǎn)離心30 分鐘取上清。
3. 細(xì)胞上清液：3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘去除顆粒和聚合物。
4. 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘取上清。
5. 保存：如果樣本收集后不及時(shí)檢測(cè)，請(qǐng)按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復(fù)凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

特點(diǎn)：
1. 即開即用，用戶只需要提供病毒樣品。
2. 根據(jù)地黃保守序列設(shè)計(jì)的專一性引物，與相關(guān)病毒無(wú)交叉反應(yīng)。
3. 靈敏度可以達(dá)到幾百拷貝/反應(yīng)。
4. 一管式熒光定量 PCR 檢測(cè)，避免后續(xù)污染。
5. 本試劑盒足夠 50 次 20μL 反應(yīng)體系的熒光定量 PCR。
6. 本產(chǎn)品只適用于科研，不能用于臨床診斷。

使用方法：
一、樣品采集：
1、食品樣品：樣品的采集與預(yù)培養(yǎng)按照樣品的采集與預(yù)培養(yǎng)按照《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)阪崎腸桿菌檢驗(yàn)要求進(jìn)行。
2、血液樣品：用無(wú)菌注射器抽取受檢者靜脈血2mL，注入無(wú)菌EDTA2Na(或檸檬酸鈉)抗凝管，立即混勻。
3、糞便樣品：取糞便置于滅菌的收集管中送檢。
4、病灶部位樣品：取發(fā)病部位新鮮滲出物、粘液膿血送檢。
一、稀釋 PCR 陽(yáng)性對(duì)照（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例）
1. 注意：由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬(wàn)不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽(yáng)性對(duì)照，只提供可以直接使用的 DNA段作為陽(yáng)性對(duì)照。
2. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
3. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液（用帶芯槍頭，下同）。
4. 在 7 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照，充分震蕩 1 分鐘，得1×10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。
5. 換槍頭，在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。
6. 換槍頭，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照到 5 號(hào)管中，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。
7. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。
注：上述樣品建議經(jīng)過增菌后，收集培養(yǎng)物用于檢測(cè)。 
二、DNA提取：
可采用PCR試劑盒配備的DNA抽提液，按以下說明進(jìn)行DNA核酸的粗提。也可采購(gòu)上海澤葉生物科技有限公司生產(chǎn)的DNA提取試劑盒(過柱法-熒光配套)或其他合適的商業(yè)化產(chǎn)品，并按照相應(yīng)試劑盒說明進(jìn)行操作。
1、液體培養(yǎng)物：取液體培養(yǎng)物100μL加到1.5mL無(wú)菌離心管中，8000rpm離心3min，盡量吸棄上清，加入50μL DNA抽提液充分混勻，100℃恒溫10min，13000rpm離心3min，取上清5μL進(jìn)行PCR反應(yīng)。
2、固體培養(yǎng)物：挑取單克隆菌落與50μL DNA抽提液充分混勻，100℃恒溫10min，13000rpm離心3min，取上清5μL進(jìn)行PCR反應(yīng)。
3、糞便樣品：挑取米粒大小糞便于滅菌離心管中，加入0.5mL生理鹽水，振蕩混勻，13000rpm離心3分鐘，棄上清，沉淀中加入50μL DNA抽提液充分混勻，100℃恒溫10min，13000rpm離心3min取上清5μL進(jìn)行PCR反應(yīng)。
4、其他液體標(biāo)本：取標(biāo)本2-3mL，13000rpm離心3min，棄上清，沉淀中加入50μL DNA抽提液充分混勻，100℃恒溫10min，13000rpm離心3min取上清5μL進(jìn)行PCR反應(yīng)。
注：陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照為已經(jīng)抽提好的核酸(無(wú)需提取)，直接取5μL加入到反應(yīng)體系中即可。由于陽(yáng)性對(duì)照濃度較高，建議在樣品制備區(qū)域加入陽(yáng)性對(duì)照。 
SELE Others Human 人 E-Selectin / CD62E 人細(xì)胞裂解液 (陽(yáng)性對(duì)照) Methocarbamol質(zhì)量規(guī)格：>98.5%,USP 32

人羊膜細(xì)胞;WISH（標(biāo)準(zhǔn)品）Methocarbamol質(zhì)量規(guī)格：HPLC>98%,標(biāo)準(zhǔn)品

CD3D Others Mouse 小鼠 CD3d / CD3 delta 人細(xì)胞裂解液 (陽(yáng)性對(duì)照) 甲基潑尼龍Methylprednisolone質(zhì)量規(guī)格：>97%,BR,可用于細(xì)胞培養(yǎng)

人尿道上皮細(xì)胞*培養(yǎng)基 100mL甲基潑尼龍（標(biāo)準(zhǔn)品）Methylprednisolone質(zhì)量規(guī)格：HPLC>97.5%,標(biāo)準(zhǔn)品

Neuro-2a細(xì)胞，小鼠腦神經(jīng)瘤細(xì)胞 MDA-MB-231(癌細(xì)胞) 人腦瘤細(xì)胞;SF767（慢心率）Mexiletine 質(zhì)量規(guī)格：>98%,BR
EB病毒轉(zhuǎn)化的人B細(xì)胞;KM9401 人血管內(nèi)皮細(xì)胞*培養(yǎng)基 100mLN-(2-丁二酰)氟伏沙明N-(2-Succinyl) Fluvoxamine質(zhì)量規(guī)格：美國(guó)進(jìn)口

非必需氨基酸　100XNEAA福辛普利Fosipril質(zhì)量規(guī)格：美國(guó)進(jìn)口

MAP2K4 Others Mouse 小鼠 MKK4 / MEK4 / MAP2K4 桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞裂解液 (陽(yáng)性對(duì)照) (R)-鹽酸氮卓斯汀(R)-Azelastine 質(zhì)量規(guī)格：美國(guó)進(jìn)口

人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞;NCI-H4469-去氧-9a-氮雜-同型A 去甲9-Deoxo-9a-aza-9a-homo Erythromycin A Desmethyl Azithromycin質(zhì)量規(guī)格：美國(guó)進(jìn)口

L6565細(xì)胞，小鼠L6565白血病克隆細(xì)胞系 人胃癌細(xì)胞,MKN-28細(xì)胞 猴源細(xì)胞Azithromycin質(zhì)量規(guī)格：美國(guó)進(jìn)口
IL17RA Others Rat 大鼠 IL17RA / IL17R 人細(xì)胞裂解液 (陽(yáng)性對(duì)照) 耐斯糖（標(biāo)準(zhǔn)品）質(zhì)量規(guī)格：含量測(cè)定NISTOSE

原代腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞特制無(wú)血清添加劑Many types of cells包裝：1ml對(duì)羥基苯乙酮（標(biāo)準(zhǔn)品）質(zhì)量規(guī)格：供含量測(cè)定用4'-Hydroxyacetophene

OS-732細(xì)胞，骨肉瘤細(xì)胞(瘤株) 人細(xì)胞,SiHa細(xì)胞 人脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞總RNAHA-sp NA3,29-二苯甲酰基栝樓仁三醇（標(biāo)準(zhǔn)品）質(zhì)量規(guī)格：含量測(cè)定3,29-Dibenzoyl rarounitriol

非洲綠猴腎細(xì)胞系/IgR;VERO/IgR牛磺（標(biāo)準(zhǔn)品）質(zhì)量規(guī)格：含量測(cè)定TAUROHYODEOXYCHOLIC ACID  SALT

FZD5 Others Human 人 Frizzled-5 人細(xì)胞裂解液 (陽(yáng)性對(duì)照) 苦玄參苷X（標(biāo)準(zhǔn)品）質(zhì)量規(guī)格：HPLC≥97%,標(biāo)準(zhǔn)品Picfeltarraenin X
川牛膝探針法PCR鑒定試劑盒說明書CRT細(xì)胞，神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞 曲霉 人海馬趾星形膠質(zhì)細(xì)胞RNAHA-h miRNA5 μg2-Octal2-辛醇25克AR，97%

RTE(大鼠氣管上皮細(xì)胞) 5×106cells/瓶×21,12-十八烷二醇 1,12-OCTcDqCcNqDIOL 76-73-0

HBL-100(人整合SV40基因的上皮細(xì)胞) 5×106cells/瓶×2 CL-0361HPAC(人胰腺腺泡上皮癌)5×106cells/瓶×2 水牛皮膚成纖維樣細(xì)胞;WB-S2肖醋錳50%溶液 Mcngcus nitnctq hqxchyd
實(shí)驗(yàn)流程：
1. 整個(gè)檢測(cè)過程應(yīng)嚴(yán)格按照本說明書要求分別在試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本處理區(qū)和PCR擴(kuò)增區(qū)進(jìn)行操作，各區(qū)實(shí)驗(yàn)服、儀器 、耗材應(yīng)獨(dú)立使用，不能混用；實(shí)驗(yàn)用吸頭采用帶濾芯吸頭；樣本處理區(qū)應(yīng)配有生物安全柜，樣本處理在生物安全柜中進(jìn)行操作；三個(gè)區(qū)應(yīng)該配有紫外線殺菌裝置。
2. 為避免RNA降解，樣本處理過程應(yīng)在0-4℃條件下操作，且完成實(shí)驗(yàn)后立即上機(jī)檢測(cè)；樣本處理過程中使用的器具耗材應(yīng)經(jīng)過無(wú)核酶處理。

3. 每次實(shí)驗(yàn)應(yīng)該設(shè)置陰、陽(yáng)性對(duì)照。
4. 試劑盒所有試劑在使用前應(yīng)該在常溫下充分融化混勻，并應(yīng)瞬時(shí)離心。
5. 試劑盒內(nèi)所配陰性和陽(yáng)性對(duì)照在一次使用前應(yīng)全部轉(zhuǎn)移至標(biāo)本準(zhǔn)備區(qū)，并單獨(dú)存放。
6. 為防止熒光干擾，應(yīng)避免裸手直接接觸PCR反應(yīng)管，并應(yīng)避免在PCR反應(yīng)管上進(jìn)行任何標(biāo)記。
7. 儀器 擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)應(yīng)按照本說明書相關(guān)要求進(jìn)行設(shè)置；不同批號(hào)試劑不能混用。
8. ABI系列熒光定量PCR儀參數(shù)設(shè)置中不選ROX校正，淬滅基因選擇None。
9. 實(shí)驗(yàn)過程中產(chǎn)品的廢棄物應(yīng)該進(jìn)行無(wú)害化處理后方可丟棄。