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      T4 UvsX Recombinase

      更新時間:2024-12-04

      簡要描述:

      T4 UvsX Recombinase儲存:置于-20°C 可保存 1 年,-80°C 長期保存,短期使用置于 4°C,保存一個月,避免反復凍融。

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      公司產品僅供科研研究使用、不得用于臨床診斷!

      商品屬性

      貨號

      產品名稱

      規格

      P-PR1402

      T4 UvsX Recombinase

      300μg

      P-PR1402

      T4 UvsX Recombinase

      3mg

      產品介紹:

      UvsX 重組酶,來源于 T4 噬菌體,是 RecA/Rad51家族的同源體。RecA/Rad51 重組酶家族在雙鏈 DNA 斷裂的無誤修復和復制叉重新啟動的過程中起到重要作用。
      T4 UvsX 重組酶可與其他重組酶一起錨定在單鏈 DNA 上并激活其在其他雙鏈 DNA 上尋找同源序列,以進一步完成鏈置換。經檢測,該酶無核酸酶活性。

      儲存:

      置于-20°C 可保存 1 年,-80°C 長期保存,短期使用置于 4°C,保存一個月,避免反復凍融。
      熱失活:60°C,10min。
      酶儲存液:50 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1 mM DTT, 0.1 mM
      EDTA, 10% Trehalose, pH 7.5。2xRPA BufferMix:包含反應緩沖鹽、ATP、磷酸肌酸、dNTP、PEG、DTT、BSA 等,可用于 RPA 擴增試驗。該試劑 4°C
      條件下放置 1 個月性能無下降。
      基于本蛋白進行 RPA 反應測試的全套試劑

      用于 RPA 擴增的測試引物與探針
      CPV-F(20uM) CACTTACTAAGAACAGGTGATGAATTTGCTACAG
      CPV-R(20uM) AGTTTGTATTTCCCATTTGAGTTACACCACGTCT
      Probe(10uM) CCTCAAGCTGAAGGAGGTACTAACTTTGGT[dT-BHQ1]
      [THF][dT-FAM]ATAGGAGTTCAACAAG -(C3)
      Canine parvovirus type 2,VP2
      加入 1μl 的模板 DNA,上機反應前加入 1.25 μl 的 280 mMMg(OAC)2(終濃度 14 mM),總反應體積 25 μl。混合均勻,并離心,置于 39-42℃條件下反應 30min。
      2. 進行熒光 RPA 擴增在進行熒光檢測時體系中,額外加入 0.3 μl 的 10μM Probe(120 nM的終濃度)和 50U 的 Exonuclease III(2U/μl 的終濃度),即可進行熒光檢測。本方法應用原理為 ExoIII 切割 THF 位點,使熒光與猝滅基團分離,報告熒光信號。
      特別說明:
      (1) 以上 RPA 擴增測試屬于蛋白功能性測試,按照以上實驗操作流程,可獲得 RPA 擴增產物。進一步的優化,包括:X、Y、GP32、聚合酶、反應 Buffer,甚至加樣順序,均可能進一步提高 RPA 的擴增性能。
      (2)關于 DNA 聚合酶的選擇, 測試了三種常見的 DNA聚合酶,在進行熒光法測定時,推薦的選擇順序依次為 Bst 4.0>Bsu> Sau,且在 42℃條件下,總能獲得最快的擴增速度,且熒光信號更強。在 Basic 擴增中 Sau 表現出特異性擴增能力更佳。
      (3)關于 RPA 的靈敏度與非特異擴增,在 Basic 試劑的擴增中,仍然存在非特異擴增產物,這需要進一步優化反應組分及引物序列。在使用熒光探針法時,但由于特異性探針的存在,非特異擴增產物通常無熒光信號值,但此時會影響檢測靈敏度。GP32 蛋白的
      濃度增加會顯著降低非特異性擴增,但會導致擴增速度減緩,此時需要同步增加 X 與 Y 蛋白的用量,以維持 RPA 的擴增速度。
      (4)據文獻報道,在進行試紙條 RPA 實驗時,傾向使用 Nfo 內切酶又名 Endonuclease IV, 來對擴增探針進行切割,但  未予測試,目前無法提供相應參數。
      (5)RPA 反應 Buffer 對擴增至關重要,輕微的濃度差異,均可導致擴增效率大幅下降,甚至失敗。RPA BufferMix 為粘稠試劑,使用時務必保證加樣準確,Tip 頭中的殘液務必打入 EP 管中。

      5.jpg

      6.png


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